以前から思っていたのですが、盛んに学とみ子は酸浴の方法が、他の再現実験を行った研究者は再現していないというわけです。
(26日夕方最初にアップした内容を27日早朝一部変更しました)
「分化細胞を培養液につけたまま、酸性液を滴下している方法は、丹羽氏以外の他の実験者はやっていないでしょう。小保方氏が編み出した方法なんでしょうね。しかし、他の再現実験ではやられていません。」
STAP細胞作成プロトコルが4つもあるのは異常だとすでに言われていますが、その通りで、つまり酸浴細胞は論文通りできないことを著者等が白状しているようなものです。
学とみ子は小保方氏や丹羽氏は「分化細胞を培養液につけたまま、酸性液を滴下している方法」だというのですがそうでしょうか。改めてチェックしてみます。
1️⃣Nature Article
After cell sorting, 1 X10^6 CD45-positive cells were treated with 500 µl of low-pH HBSS solution (titrated to pH5.7 by HCl) for 25 min at 37 ℃, and then centrifuged at 1,000 r.p.m. at room temperature for 5 min.
細胞選別後、CD45陽性細胞1×10^6個を、塩酸でpH5.7に調整した低pH HBSS溶液500 µl中で37℃にて25分間処理し、その後、室温で1,000 r.p.m.にて5分間遠心分離した(DeepL訳)。
2️⃣丹羽プロトコルhttps://www.protocols.io/view/essential-technical-tips-for-stap-cell-conversion-36wgqdz93vk5/v1
5 After cell sorting, 1 × 10^6 CD45+ cells were treated with 500 µl of low-pH HBSS solution (titrated to pH 5.7 by HCl) for 25 min at 37°C, and then centrifuged at 1,000 rpm at room temperature for 5 min.
細胞選別後、1×10⁶個のCD45+細胞を、500 µlの低pH HBSS溶液(塩酸でpH 5.7に調整したもの)に37°Cで25分間処理し、その後、室温で1,000 rpmで5分間遠心分離した(DeepL訳)。
5.1 The buffering action of HBSS is weak, so carry-over of the solution may affect pH. Please adjust pH to 5.7 in cell suspension by the following method. First, suspend the cell pellet with 494 µl of HBSS pre-chilled at 4°C, then add 6 µl of diluted HCl (10 µl of 35% HCl in 590 µl of HBSS) to adjust to a final pH of 5.7. Please confirm the final pH in a pilot experiment, and optimize the volume of HCl added, as necessary. Alternatively, suspend the cell pellet in HBSS-pH 5.4 pre-chilled at 4°C.
HBSSの緩衝作用は弱いため、溶液の持ち越しがpHに影響を与える可能性があります。以下の方法に従って、細胞懸濁液のpHを5.7に調整してください。まず、4°Cで予冷したHBSS 494 µlで細胞ペレットを懸濁させ、次に希釈したHCl(35% HCl 10 µlをHBSS 590 µlに溶解したもの)6 µlを加えて、最終pHを5.7に調整してください。予備実験で最終pHを確認し、必要に応じてHClの添加量を最適化してください。あるいは、4°Cで予冷したpH 5.4のHBSSを用いて細胞ペレットを懸濁させることも可能です(DeepL訳)。
3️⃣Vacantiプロトコルhttps://web.archive.org/web/20140321094008/http://research.bwhanesthesia.org/research-groups/cterm/stap-cell-protocol
A6. Add HBSS to the suspension to a total volume of 20ml, centrifuge at 1200rpm for 5 minutes and then aspirate the supernatant.
A7. Resuspend the cells in HBSS at a pH of 5.4, at cell concentration of 2 million cells/ml, then place in an incubator at 37°C for 25 minutes.
A6. 懸濁液にHBSSを加えて総容量を20mlとし、1200rpmで5分間遠心分離した後、上清を吸引する。
A7. 細胞をpH 5.4のHBSSで200万細胞/mlの濃度になるように再懸濁し、37°Cのインキュベーターで25分間培養する(DeepL訳)。
4️⃣小保方プロトコルSTAP HOPE PAGE https://archive.md/cJifN
11. Add 500μl of HBSS and suspend a cell pellet using a 1000μl-pipette***
12. Take out 6μl of the cell suspension for cell counting
13. Add 6μl of ATP solution(ほぼ飽和のATP液) (At this moment, the color of HBSS changes from red to yellow)
14. Incubate the cells horizontally at 37℃ (in the 5% CO2 incubator) for 15 min**** (During this time, count the number of cells)
11. HBSSを500μl加え、1000μlピペットを用いて細胞ペレットを懸濁させる***
12. 細胞懸濁液から6μlを採取し、細胞数を測定する
13. ATP溶液(ほぼ飽和のATP液)を6μl加える(この時点で、HBSSの色が赤から黄色に変化する)
14. 細胞を水平に保ち、37℃(5% CO₂インキュベーター内)で15分間インキュベートする****(この間に細胞数を計数する)
とあって、pHを測定していない。
論文、丹羽プロトコルの“500 µl of low-pH HBSS solution (titrated to pH 5.7 by HCl)”は「低 pH の HBSS 溶液」を作っておき、そこへ CD45+ 細胞(1×10^6 cells)を加えて25分間 37°C で処理した、ということ(下記*)で、学とみ子の言うような細胞が入っている培養液に塩酸を滴下してpHを5.7にしたのではないのです。丹羽氏のプロトコルは論文と一致していますが、5.1 として補足?に細胞懸濁液に希釈塩酸を加える方法と、あらかじめ酸性にした冷やした培養液に細胞を加える方法も書いてあります。3種類もあって、どの方法がいいのか書いてないというお粗末なもので、これは丹羽氏自身が実施したのではなく、小保方氏から聞き取って書いたためのようです。プロトコルを実際にやったことのない方が書くというのはあまりにもお粗末です。
つまり学とみ子の言う「分化細胞を培養液につけたまま、酸性液を滴下」というプロトコルは基本的にないのです。学とみ子は(titrated to pH 5.7 by HCl)を読み違えているのです。細胞懸濁液に塩酸あるいはATPを滴下するというのは、実施したのか疑わしい丹羽氏プロトコルの一部と小保方氏のプライベートなWebページにある論文記載と違うものだけで、どれがSTAP細胞作成に最適なプロトコルなのかわからないのです。いずれにしろ、論文にあるような量の細胞は、小保方氏自身ですら、できなかったので意味はないのですけどね。
>学とみ子
「分化細胞を培養液につけたまま、酸性液を滴下」というのはどこに書いてある方法を読んで発言しているのでしょうか?当方が挙げた以外にあるのでしょうか?
*
Q: After cell sorting, 1 × 10^6 CD45+ cells were treated with 500 µl of low-pH HBSS solution (titrated to pH 5.7 by HCl) for 25 min at 37°C, and then centrifuged at 1,000 rpm at room temperature for 5 min. という方法は「あらかじめ塩酸を滴下してpHを5.7 にした HBSS液に細胞を入れた」と「細胞の入ったHBSS液に塩酸を滴下してpHを5.7にした」のどちらですか?
ChatgGPT: この英文の解釈としては、
> “500 µl of low-pH HBSS solution (titrated to pH 5.7 by HCl)”
となっているので、
**「あらかじめ塩酸(HCl)で pH 5.7 に調整しておいた HBSS 溶液を用意し、その低pH HBSSに細胞を入れて処理した」**
という意味です。
つまり、後者の
> 「細胞の入ったHBSS液に塩酸を滴下して pH 5.7 にした」
ではありません。
理由としては、英語で “HBSS solution (titrated to pH 5.7 by HCl)” が HBSS 溶液自体を修飾しており、「HBSS を HCl で pH 5.7 に調整した溶液」という構造になっているためです。
実験操作としても、通常は:
1. HBSS を別容器で HCl により pH 5.7 に調整
2. その low-pH HBSS を細胞へ添加
3. 37°Cで25分処理
という流れになります。細胞懸濁液に直接 HCl を滴下すると、局所的な急激なpH低下が起きやすく、再現性も悪くなるため、一般的な記載法ではありません。













